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HpGreen是一款过氧化氢选择性探针。探针本身无荧光，可见光区域内无吸收峰。一旦接触H2O2，瞬间激发荧光增加并伴随可见波长吸收带的生成（Ex/Em= 490/514nm）。因其二元的吸收/发射荧光反应，此探针具有较大的动力学范围。与相似的ROS比如O2–，NO，或OCl-相比，HpGreen探针对H2O2呈现出＞100倍的选择性。

过氧化氢（Hydrogen peroxide,H2O2）是一种反映氧代谢副产物，用于许多氧化应激相关态的关键调节剂，参与人体大量的生理和病理活动，比如哮喘、动脉粥样硬化、糖尿病血管病变、神经性衰退疾病和唐氏综合征等，但目前对H2O2生成、积累、运输和功能的分子机制仍了解很少，最大的限制在于缺乏灵敏且特异性H2O2探针，用于活细胞研究。常规的H2O2反应性探针的缺陷包括以下几个方面。

• 来自其他ROS比如过氧亚硝基阴离子（ONOO-）、过氧化基（ROO·）、超氧化物（·O2–）的背景荧光干扰；
  
• 对外源活化酶的需求；
  
• 水缺乏水溶性或不兼容于水溶体系；
  
• 以及紫外区域的激发光谱特征等。

• 本品的DMSO储存液需分装成单次用量后，-20℃避光保存，避免反复冻融。所有工作液现配现用。
  
• 整个操作过程中注意避光。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 储存液制备
  将低温保存的产品从冰箱取出，置于室温回温至少20min。低速离心3～5min。之后往瓶内加入适量无水DMSO充分溶解配成2～5mM储存液（比如，1mg HpGreen过氧化氢探针（Mw:~600）加入333μL DMSO，充分溶解混匀后即得到5mM储存液）。按照单次用量分装冻存，避免反复冻融，至少3个月稳定。
  
• 工作液准备
  
  • 正式实验前，或取粉末按照“储存液制备”用DMSO溶解，或于室温融化一管DMSO储存液。
  • 对于溶液H2O2测定，按照2～20μM工作液浓度制备2×工作液，用20mM Hepes缓冲液或其他缓冲液（pH7.0）稀释储存液。工作液现配现用。建议使用5μM终浓度的HpGreen过氧化氢探针，测定溶液体系中H2O2浓度。
    
  • 对于细胞H2O2测定，按照2～20μM工作液浓度制备1×工作液，用含20mM Hepes缓冲液的HBSS，pH7.0或PBS稀释储存液。工作液现配现用。
• 上清液H2O2测定
  
  • 以下为溶液H2O2测定的推荐步骤，仅作参考，请根据具体需求做优化调整。
  • 于96孔板，加50μL 2×HpGreen过氧化氢探针工作液到每个孔（H2O2标准、空白对照、待测样本）内使总的测定体积为100μL/孔。
    
    • 对于384孔板，加25μL样品和25μL 2×HpGreen过氧化氢探针工作液，使得测定体积为50μL/孔。
  • 室温避光孵育反应体系15～60min。
    
  • 荧光酶标板内监测用荧光增强，Ex/Em=490/525nm。
    
  • 空白孔（只含有反应缓冲液）的荧光用作对照，其他孔的荧光值需减掉空白对照孔荧光。
• 活细胞H2O2测定
  
  • HpGreen过氧化氢探针能主动扩散进入活细胞，且能反映胞内H2O2微摩尔浓度变化。以下是推荐的活细胞H2O2显微成像检测步骤，仅作参考，可根据具体需求优化调整。
  • 按照步骤2b配制1×HpGreen过氧化氢探针工作液。工作液现配现用。
    
  • 按照实验要求处理细胞。
    
  • 用1×HpGreen过氧化氢探针工作液避光孵育细胞5～60min或适合自身需求的时间。用PBS清洗细胞2次。
    
  • 用荧光酶标板（底部读数模式）监测荧光增强，Ex/Em=490/525nm。或者用荧光显微镜的FITC通道成像检测荧光增强。